O’Neill wurde am 16.Oktober 1988 in einem Familienhotel in New York als dritter Sohn geboren. Der zweite Bruder Edmund war schon mit 1 1/2 Jahren an Masern gestorben, der im Beruf erfolglose ältere Bruder verfiel später dem Alkohol. Sein Vate war Schauspieler und als Kind lernte O´Neill so schon früh das Theater kennen.
Nach dem Schulabschluss immatrikulierte er im Herbst 1906 an der Universität Princeton, wurde aber schon im Juni 1907 wegen eines Regelverstoßes entlassen. Er hatte eine Bierflasche durch ein Fenster des Universitätspräsidenten und späteren US-Präsidenten Woodrow Wilson geworfen.
Danach wechselte er von einem Job zum anderen. Im Oktober 1909 heiratet er die junge New Yorkerin Kathleen Jenkins. Noch im selben Jahr reiste er nach Honduras, musste jedoch bald malariakrank nach New York zurückkehren.
O’Neills Vater machte ihn zum „Assistant Manager“ seiner Truppe, und er reiste mit ihr von St. Louis bis Boston. Eugene, den der Job wenig interessierte, trat bald nach dem Ende der Spielzeit seine erste Seereise an. Nach einer Fahrt nach Südafrika war er längere Zeit völlig mittellos. Am Strand von Buenos Aires, später in New York und Liverpool führte er das Leben eines Obdachlosen.
Nach einem Selbstmordversuch im Jahr 1912 und der Scheidung seiner kurzen Ehe mit Kathleen Jenkins im selben Jahr brach er im Dezember 1912 gesundheitlich zusammen. In einem Sanatorium in Connecticut blieb er fünf Monate, um seine Tuberkulose auszuheilen.
Er las dort wie besessen Werke von Ibsen, Strindberg, Nietzsche und Dostojewski und fühlte sich angetrieben, Dramatiker zu werden. Nach seiner Entlassung zog er zu einer befreundeten englischen Familie und blieb er über ein Jahr.
In etwa 15 Monaten verfasste er elf Einakter, zwei mehraktige Dramen und einige Gedichte. Für sein Drama "Jenseits vom Horizont" erhielt O’Neill 1920 den Pulitzer-Preis. Als erster amerikanischer Dramatiker wurde er 1936 mit dem Nobelpreis für Literatur ausgezeichnet.
1953 starb er in einem Bostoner Hotel an Tuberkulose. „Born in a hotel-room and God-damned, died in a hotel-room“, sollen seine letzten Worte gewesen sein.
